28%临床抗体脱靶，背后的分子机制与工程化解决路径

前言

单克隆抗体（mAb）经过四十余年的发展，已成为生物医药领域最成功、最成熟的药物模态之一。截至目前，全球已有超过130个抗体药物获批上市[1]，在治疗肿瘤、自身免疫病、代谢性疾病和感染性疾病等领域发挥着不可替代的作用。抗体药物之所以能够获得如此广泛的临床应用，其核心优势一直被归结为"高特异性"——即通过可变区（Variable region）与靶抗原的精确互补，实现对特定信号通路的精准调控，同时避免对正常组织的误伤。然而，这种对特异性的传统认知，在很大程度上建立在"序列决定结构、结构决定功能"的线性逻辑之上，并且往往默认：能够通过临床前安全性评价和人体临床试验的抗体分子，其脱靶风险已经得到了充分控制。

图1. Off-target reactivity in clinical monoclonal antibodies.[2]

耶鲁大学教授Aaron Ring团队联合Fred Hutchinson癌症中心和Adimab公司，在《Structure》期刊发表的最新研究[2]，系统性地挑战了这一假设。研究团队利用其开发的REAP（Rapid Extracellular Antigen Profiling）平台[3]，对174个FDA已批准或处于临床后期的单克隆抗体进行了全蛋白质组水平的脱靶扫描，筛选文库覆盖了6,172个人类细胞外蛋白，涵盖全长天然构象抗原和线性表位。研究结果揭示了一个令行业警醒的事实：在这些已经通过严苛筛选、进入临床甚至上市销售的抗体中，仍有28%存在至少一个明确的脱靶结合[2]。这一数字不仅远高于此前行业内的经验性估计，更重要的是，研究进一步揭示这些脱靶事件大多不是传统意义上的"非特异性黏附"（polyreactivity），而是由清晰的结构生物学机制驱动的特异性交叉反应。这一发现对抗体药物的早期发现策略、临床安全性评估以及下一代高细胞毒性疗法（如T细胞引导疗法、CAR-T、ADC等）的开发具有深远的指导意义。

1、REAP平台的技术突破与筛选逻辑

REAP平台基于酵母表面展示技术（yeast surface display）[3]，其核心创新在于将6,172个人类细胞外蛋白以全长天然构象或线性表位的形式，分别独立展示在酵母细胞表面。每个蛋白都保持了其天然的三维结构和潜在的翻译后修饰模式，这为检测构象依赖性表位（conformational epitope）提供了基础。具体流程上，待测抗体首先与酵母文库孵育，通过Protein G磁珠进行初步富集（MACS），随后利用荧光标记的流式细胞术（FACS）进行高灵敏度分选，最后通过高通量测序计算每个蛋白在筛选前后的丰度变化（Log2 fold change），以REAP score ≥ 2作为阳性结合的阈值[2]。

图2. REAP平台的技术流程[3]

正是这种"全蛋白质组×天然构象"的筛选策略，使得REAP能够捕捉到常规方法无法发现的寡特异性（oligospecificity）事件。寡特异性抗体指的是能够特异性识别两个或多个不相关抗原的抗体，其结合是由明确的分子互作界面介导的，而非静电或疏水作用驱动的非特异黏附。研究中一个极具说服力的对比是：Tanezumab的PSR（Polyspecificity Reagent）评分仅为0.17（属于低多反应性），但在REAP筛选中却清晰地显示出对TSLP（Thymic Stromal Lymphopoietin）的特异性结合。

2、28%脱靶率的深层含义

从《Cell》的抗肿瘤研究到DMD的治疗突破，GLUD1的研发价值正在不断被验证，但“多面手”靶点的特性决定了其研发之路必然充满“暗礁”。忽视脱靶风险的研发，就像盲人摸象，即便短期内看到疗效希望，后期也可能因安全性问题功亏一篑。

深耕药物安全性评价领域，专注脱靶检测技术研发，就是希望成为药企研发路上的“排雷专家”。我们相信，只有在临床前阶段充分排查脱靶风险，才能让药物在临床试验中走得更稳、更远，最终为患者带来有效且安全的治疗方案。

在174个受试抗体中，126个（72%）未检测到任何脱靶结合，这一比例印证了临床级抗体确实具备较高的特异性基础。然而，30个抗体（17%）存在至少一个脱靶结合，18个抗体（10%）存在两个或以上脱靶结合，总体脱靶率达到28%[2]。这一数据之所以重要，不仅在于其比例超出预期，更在于其分子机制的清晰度。

图3. REAP平台筛选临床抗体的脱靶结合概况[2]

（a）174个受试抗体的脱靶结合分布：72%未检测到脱靶，17%有1个脱靶，10%有≥2个脱靶（寡特异性）。（b）PSR评分与脱靶数量的相关性分析，显示PSR评分无法预测特异性脱靶（如Tanezumab的PSR=0.17但存在TSLP脱靶）。

研究将脱靶模式归纳为两大类：结构同源蛋白间的交叉反应（structural homology-driven ss-reactivity）和表位模拟（epitope mimicry）。前者发生在同一蛋白超家族成员之间，后者则发生在完全无关的蛋白之间。这两种机制共同指向一个核心结论：抗体的特异性不能完全由其靶抗原的序列唯一决定，而是一个需要在全蛋白质组尺度上实验验证的复杂属性。

2.1 结构同源蛋白间的交叉反应与分子机制

当靶点与脱靶蛋白属于同一结构家族时，即使二者的一级序列差异显著，共享的折叠拓扑和保守的功能性表面仍可能导致抗体交叉识别。

Tralokinumab是一种靶向白细胞介素13（IL-13）的全人源化抗体，已获批用于治疗特应性皮炎和哮喘[4]。IL-13与IL-4同属短链细胞因子家族（short-chain cytokine family），二者均呈现典型的四α-螺旋束（four-helix bundle）拓扑结构，但它们的全局序列相似性仅为28%，通常被认为具有足够的区分度。然而，REAP筛选清晰显示Tralokinumab能够与IL-4发生交叉结合，且BLI（Biolayer Interferometry）测定其亲和力（KD）达到2.93 nM[2]。

结构生物学分析揭示了其分子基础：Tralokinumab在IL-13上的表位位于受体结合界面附近，特别是涉及IL-13Rα1和IL-13Rα2结合的关键区域[4]。通过结构比对发现，IL-13上的这些表位残基在IL-4的对应空间位置存在相同或保守的氨基酸，形成了保守的功能性表面。这意味着Tralokinumab的交叉反应并非随机，而是精准地识别了两个细胞因子在进化中保留的受体结合界面。从药理学角度看，虽然Tralokinumab对IL-13的亲和力高于IL-4，但2.93 nM的亲和力已足以在体内实现功能性阻断，这意味着在特定剂量和药代动力学条件下，IL-4信号通路可能被意外抑制，从而影响Th2免疫反应的精确调控。

另一个更具启发性的案例是Ociperlimab，这是一种靶向免疫检查点TIGIT（T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains）的抗体。REAP筛选发现Ociperlimab能够特异性结合NECTIN4（Nectin cell adhesion molecule 4）[2]。TIGIT与NECTIN4均含有Ig样V型结构域（IgV domain），整体序列相似性约26%，但在结构折叠上高度相似。更深层的机制在于表位层面的精确模拟：Ociperlimab在TIGIT上的已知表位包含15个关键残基，其中6个（40%）在NECTIN4中完全保守[5]。

特别值得注意的是组氨酸H76。在Ociperlimab与TIGIT的相互作用中，H76是一个关键的pH敏感性残基——在肿瘤微环境或内体（endosome）的酸性条件下（pH ~6.0），H76质子化后与抗体的互补决定区（CDR）形成增强的氢键或盐桥，从而显著提升结合亲和力[5]。这一pH依赖性特征被视为Ociperlimab的设计亮点，旨在使其在酸性肿瘤微环境中增强滞留。然而，结构比对显示，NECTIN4中的H89与TIGIT的H76在空间上精确对齐。BLI实验证实，Ociperlimab对NECTIN4的结合同样呈现强烈的pH依赖性：在pH 7.4时亲和力为3.7 nM，而在pH 6.0时增强至2.0 nM[2]。

图4. 结构同源蛋白间的交叉反应机制验证[2]

（a）Ociperlimab表位残基在TIGIT与NECTIN4间的保守性比对，40%的表位残基（包括pH敏感的H76/H89）完全保守[2,5]。（b）Ociperlimab对NECTIN4的pH依赖性结合，在pH 6.0时亲和力（2.0 nM）显著高于pH 7.4（3.7 nM），复现了其在TIGIT上的结合特性。

这种"结构-功能偶联的交叉反应"揭示了一个重要风险：针对免疫检查点设计的抗体，其表位如果位于受体-配体界面的保守区域，那么同源家族成员（如NECTIN家族的其他成员）很可能成为意想不到的脱靶。由于免疫检查点网络本身具有复杂的交叉对话（cross-talk），这种脱靶可能干扰正常的免疫监视功能。

2.2 表位模拟与功能性脱靶的临床风险

如果说结构同源蛋白间的交叉反应尚有规律可循，那么完全无关蛋白之间的表位模拟（epitope mimicry）则是抗体特异性评估中真正的"暗物质"。这种脱靶模式的核心特征是：靶点与脱靶蛋白在一级序列和整体折叠上毫无关联，但抗体识别的表位在三维空间上巧妙重叠，且往往位于功能性界面。

Tanezumab（抗NGF）与TSLP（Thymic Stromal Lymphopoietin）的脱靶结合，是这项研究中最具冲击力的发现。NGF属于神经营养因子家族（neurotrophin family），具有特征性的半胱氨酸结（cystine knot）结构；而TSLP属于短链细胞因子家族，采用四α-螺旋束折叠。从进化角度看，这两个蛋白家族的起源完全不同，氨基酸序列相似性接近于零。然而，REAP筛选中Tanezumab对TSLP的REAP score达到5.7，表明这是一个明确且特异的相互作用[2]。

为了理解这一意外结合的分子基础，研究团队开展了系统的表位映射工作。他们利用酵母表面展示技术构建了TSLP的随机突变文库，并通过多轮FACS分选，筛选出失去Tanezumab结合但仍保持TSLPR（TSLP受体，又称CRLF2）结合的TSLP突变体。通过对246个独立突变体的测序分析，鉴定出K40、R72、R149、R150、N152、R153等关键位点——这些残基在TSLP表面形成了一个显著的电

正性补丁（electropositive patch）[2]。

基于PDB 5J11的TSLP-TSLPR共晶结构进行分子建模，研究团队发现Tanezumab在TSLP上的结合表位与TSLPR的天然结合界面存在显著的空间重叠。换言之，Tanezumab识别的是TSLP上用于结合其受体的关键功能性表面。后续的BLI竞争实验进一步证实，Tanezumab能够以69 nM的表观亲和力（avid binding format）有效阻断TSLP与TSLPR的相互作用。更惊人的是，当TSLP预先与已获批的抗TSLP抗体Tezepelumab（用于治疗严重哮喘）结合后，Tanezumab无法再与TSLP结合，反之亦然[2]。这证明两者识别的是同一或邻近的表位区域。

图5. Tanezumab对TSLP的表位模拟

Tanezumab在TSLP上的表位（橙色）与TSLPR结合界面（青色）的空间重叠分析（PDB: 5J11），揭示脱靶结合具有功能性后果的分子基础[2,6]。

这一发现的临床意义不容小觑。TSLP是2型免疫反应（Type 2 immunity）的上游主控因子，在哮喘、特应性皮炎和食物过敏等疾病中扮演核心角色。Tezepelumab作为首个获批的抗TSLP抗体，正是通过阻断TSLP-TSLPR相互作用来抑制下游的IL-4、IL-5、IL-13等炎症级联反应。而Tanezumab是一款用于治疗骨关节炎和慢性疼痛的抗NGF抗体。如果一个用于疼痛管理的患者在接受Tanezumab治疗后，其体内TSLP信号通路被意外中和，可能导致免疫稳态的紊乱——例如增加感染风险或干扰黏膜屏障功能。

这种功能性脱靶（functional off-target）——即抗体不仅结合脱靶蛋白，而且干扰其正常的受体-配体相互作用——比单纯的交叉结合具有更高的安全风险等级。它提示我们，在评估脱靶风险时，不仅要看"是否结合"，更要追问"结合在哪里"以及"结合后是否产生功能后果"。

3、工程化改造消除脱靶的可行路径

面对脱靶风险，这项研究给出了令人振奋的解决方案：通过最小化的CDR（Complementarity Determining Region）工程化改造，完全消除脱靶结合，同时保持甚至提升靶点亲和力。

研究团队以Tanezumab为模型，实施了精密的定向进化策略。他们采用NNK简并密码子对Tanezumab的六个CDR区（重链CDR1-3和轻链CDR1-3）进行单氨基酸饱和突变，构建了一个覆盖所有可能单点突变的酵母展示文库，遵循"最小突变原则"——每个重链或轻链变量区不超过3个突变位点。筛选策略采用了创新的切换式正/负选择（Toggled Selection）流程：交替使用低浓度NGF进行正选（保留靶点结合）和高浓度TSLP-Fc进行负选（排除脱靶结合），反复富集高特异性克隆。

经过多轮筛选，研究团队获得了两个代表性变体，命名为Tv1和Tv2：

Tv1变体仅在轻链CDR3（LCDR3）的第2位发生了一个氨基酸替换：谷氨酸（E）变为丙氨酸（A）。具体序列从母本的QQEHTLPYT变为QQAHTLPYT。这一单点突变完全消除了Tanezumab对TSLP的结合，而在BLI检测中对NGF的单体亲和力从母本的0.94 nM提升至0.74 nM[2]。

Tv2变体仅在重链CDR2（HCDR2）的第3位发生了一个氨基酸替换：色氨酸（W）变为丙氨酸（A）。具体序列从母本的IIWGDGTTDYNSAVKS变为IIAGDGTTDYNSAVKS。这一突变同样完全消除了TSLP脱靶，且对NGF的亲和力进一步提升至0.46 nM，比母本提高了约2倍[2]。

为了验证这些最小化改造是否引入了新的脱靶风险，研究团队将Tv1和Tv2重新提交REAP全库筛选（6,172蛋白）。结果显示，两个变体均未与TSLP结合，且在整个蛋白质组中未检测到任何新的脱靶事件[2]。在物理化学性质方面，Tv1的PSR多反应性评分从母本的0.18降至0.00，HIC（疏水相互作用色谱）保留时间从11.0分钟变为11.4分钟（疏水性降低），而Fab热稳定性（Tm）从母本的76°C显著提升至88°C。Tv2的Tm保持在75°C，PSR评分同样降至0，HIC保留时间略微降低至10.6分钟[2]。

图6. 最小化CDR工程消除Tanezumab脱靶结合[2]

（C）BLI测定显示，工程化变体Tv1和Tv2对靶点NGF的亲和力（0.74 nM和0.46 nM）相比母本（0.94 nM）显著提升。（D）SPR检测显示Tv1和Tv2完全丧失对TSLP的结合能力。（E）REAP全库筛选（6,172蛋白）验证，工程化变体不仅消除TSLP脱靶，且未引入任何新的脱靶结合。

这些数据表明，仅需单个CDR位点的单氨基酸替换，就能重塑特异性指纹，在消除脱靶的同时保持甚至提升亲和力与 developability 属性。这为药物发现提供了两条并行不悖的路径——在早期发现阶段通过大规模特异性筛选直接选择高特异性先导分子，或对已鉴定的优秀先导分子（如果存在脱靶）进行最小化工程修复。

这一结果具有深远的产业意义：它证明了脱靶并非抗体工程的"绝症"，通过理性设计的定向进化，仅需1-2个氨基酸的微调即可重塑特异性指纹，而无需对抗体整体架构进行大幅改动。这为药物发现提供了两条并行不悖的路径——在早期发现阶段通过大规模特异性筛选直接选择高特异性先导分子，或对已鉴定的优秀先导分子（如果存在脱靶）进行最小化工程修复。

4、对下一代疗法开发的深层启示

28%的脱靶率数据背后，是对当前和未来抗体药物开发策略的三重启示。

第一，特异性筛选应当前置到发现阶段。72%的临床抗体在REAP筛选中未显示脱靶，这一高比例证明高特异性是可以通过筛选获得的性状。当候选分子库足够大且多样化时，优先选择脱靶风险最低的先导分子，远比在临床前或临床阶段发现安全性问题后再进行改造要经济高效。随着噬菌体展示、酵母展示和单B细胞筛选技术的成熟，先导分子库的规模已达到10^9-10^10级别，这为实现"特异性优先"的发现策略提供了物质基础。

第二，工程化改造遵循最小突变原则。Tanezumab的成功改造表明，仅需单个CDR位点的单氨基酸替换即可消除脱靶。这一"最小突变策略"不仅降低了引入免疫原性风险的可能性，也减少了对抗体整体物理化学性质的扰动。对于已经进入IND准备阶段或临床早期但发现脱靶问题的分子，这种工程化路径提供了一种"补救方案"，避免了从头开始筛选的巨大时间和经济成本。

第三，新型高效力疗法需要更严格的特异性标准。对于传统单克隆抗体，弱的脱靶结合可能因为亲和力不足、靶组织表达量低或表位非功能性而未表现出临床毒性。然而，随着T细胞引导疗法（TCE）、CAR-T细胞疗法、抗体药物偶联物（ADC）以及放射性核素偶联物（RDC）等新型疗法的兴起，即使是微摩尔甚至纳摩尔级别的低亲和力脱靶，也可能通过T细胞杀伤、细胞毒药物释放或放射性损伤被放大为严重的on-target, off-tumor毒性。特别值得关注的是，AI设计的抗体和计算生物学方法设计的结合物，由于绕过了自然免疫系统中B细胞耐受（central tolerance）的过滤机制，可能具有更高的表位模拟脱靶风险。在这些场景中，全蛋白质组水平的特异性验证不再是可选项，而是安全性评估的必选项。

5、守衡生物：全蛋白质组特异性验证的技术支撑

从Dai等人的研究中我们可以清晰地看到，REAP这类全蛋白质组筛选平台揭示了传统方法无法触及的脱靶风险，为抗体药物的特异性评估设立了新的技术标杆。将这种学术前沿转化为产业实践，需要具备大规模文库构建、天然构象蛋白表达、高通量检测和严格质量控制的综合能力。

守衡生物科技（南京）有限公司正是专注于这一领域的先行者。自2019年成立以来，守衡生物自主构建了6000+人质粒库，建立了自动化、高通量的检测平台——人质膜蛋白阵列平台（Membrane Proteofetch Array, ）。

守衡生物MPA平台的核心优势在于其表达体系与REAP形成技术互补。不同于酵母展示系统，守衡生物采用哺乳动物细胞（如293T和CHO细胞）进行膜蛋白和分泌蛋白的瞬时表达，能够最大程度地保留蛋白的天然构象、糖基化修饰和二硫键模式。这对于检测依赖于翻译后修饰的构象表位至关重要。平台库容覆盖6000+人质膜蛋白及高置信度分泌蛋白，结合高灵敏度化学发光检测技术与流式细胞术，能够实现对大规模候选抗体的快速筛选。

6、结语

Dai等人的研究通过174个临床抗体的大规模实证数据，为我们揭示了一个不容忽视的现实：即使是经过严格筛选、已进入临床甚至上市的抗体药物，仍有近28%存在明确的蛋白质组级别脱靶结合。这些脱靶事件大多由结构同源交叉反应或表位模拟驱动，且具有潜在的功能性后果。这一发现不仅挑战了行业对抗体特异性的传统认知，更向我们发出了明确的警示——在新型高效力疗法时代，特异性筛选必须从"可选质量属性"升级为"关键安全属性"，而全蛋白质组水平的实验验证是实现这一标准的必要手段。

对于正在开发抗体药物的企业和研究机构而言，这项研究提供了清晰的技术路径：在早期发现阶段引入全蛋白质组特异性筛选，对存在脱靶的先导分子积极采用最小突变策略进行工程化改造，并对TCE、CAR-T、ADC等新型疗法保持更高的特异性标准。守衡生物自成立以来，始终专注于抗体特异性分析领域，其MPA平台已为200+个项目提供了高质量的特异性检测服务，数据报告已成功用于IND、FDA申报。无论您是处于早期发现阶段的抗体筛选，还是即将进入IND申报的关键时刻，守衡生物都能为您提供专业、高效、可靠的特异性解决方案。

让我们一起，为抗体药物的安全性保驾护航，让每一个进入临床的分子都能以最高的特异性标准服务于患者。

参考文献

[1] Crescioli, S., Kaplon, H., Chenoweth, A., Wang, L., Visweswaraiah, J., and Reichert, J.M. (2024). Antibodies to watch in 2024. mAbs 16, 2297450.

[2] Dai, Y., Brouillard, J., Jaycox, J.R., et al. (2026). Off-target reactivity in clinical monoclonal antibodies. Structure 34, 1–11.

[3] Wang, E.Y., Dai, Y., Rosen, C.E., et al. (2022). High-throughput identification of autoantibodies that target the human exoproteome. Cell Rep. Methods 2, 100172.

[4] Popovic, B., Breed, J., Rees, D.G., et al. (2017). Structural Characterisation Reveals Mechanism of IL-13-Neutralising Monoclonal Antibody Tralokinumab as Inhibition of Binding to IL-13Rα1 and IL-13Rα2. J. Mol. Biol. 429, 208-219.

[5] Sun, J., Zhang, X., Xue, L., et al. (2024). Structural insights into the unique pH-responsive characteristics of the anti-TIGIT therapeutic antibody Ociperlimab. Structure 32, 550-561.e5.

关于我们

守衡⽣物是⼀家专注于抗体特异性分析领先解决⽅案的⽣物技术公司，通过⾃主构建6000+膜蛋⽩质粒，建⽴了⾃动化、⾼通量检测平台，打造出国际首家平台，能提供“⼀站式、⼀体化”的蛋⽩⾮特异性筛选服务；为药物安全性评估提供系统的解决⽅案。

守衡生物目前完成了多例已上市的单克隆抗体脱靶性研究，提供的检测数据报告已进行了IND、FDA申报，从而解决样品国外送检时间久，沟通成本高等一系列问题，助力研发团队的研发进程和IND申报加速，减少在研发和临床实验中的投入风险。