新药脱靶评价利器----人质膜蛋白阵列技术

在靶向药物越来越追求精准化的背后，“脱靶”这个名词也亦步亦趋地出现在大众的视野中。当我们以 “on-target off-tumor”、“CAR-T off target”、“Off-target binding”等为关键词进行搜索时，可以看到与此相关的文章及报道层出不穷。“辛辛苦苦十几年，一朝脱靶解放前”是药品研发企业遇到“脱靶”困境的真实写照。如何在保证靶向药物强大疗效的同时，提高安全性，成为我们不得不关注的重要议题。无论是抗体类相关药物（如mAb、BsAb、ADC、、VH等）还是细胞治疗类药物（如CAR-T，CAR-NK，CAR-Mφ等），脱靶毒性（off-target toxicity）的问题都不容忽视。这种对非靶标组织或器官产生的毒性，不仅影响药物的药代动力学和组织分布，还可能引发严重的副作用。由于有效、可信且便捷的检测方法寥寥无几，近些年来由脱靶带来的安全性问题已然成为了行业内公认的临床前评价痛点。所以如何找到肿瘤细胞上合适的靶点，如何鉴定分子的特异性，如何尽早地预估脱靶风险成为了生物药研发的关键环节。

关于脱靶分析方法，大家较为熟悉的是人体组织交叉反应（Tissue ss-Reactivity，TCR），它是采用免疫组织化学技术（Immunohistochemistry，IHC），利用抗原与抗体特异性结合的原理，对一系列人和动物的冰冻组织切片进行染色，体外检测单抗或相关抗体样生物制品与组织上的抗原决定部位结合，以预测毒性靶器官的实验。然而，如今的治疗性抗体以逐渐从鼠源抗体转变为经体外筛选获得的全人源抗体，这显然对脱靶分析提出了更高的要求，再一个受技术本身所限，TCR实验的组织、体系、操作、结果判定以及总结报告等难以标准化等，导致TCR实验在脱靶风险评估上暴露出越来越多的弊端，业界对TCR实验在多大程度上能够指导非临床安全性和临床试验的争议也日益激烈。早在2016年，国家CFDA专家发表的《组织交叉反应试验在非临床安全性评价中的应用及案例分析》[2]一文，也对TCR技术的局限性做了讨论。

人蛋白微阵列技术是另一种脱靶分析方法，它是采用高通量自动化的蛋白表达系统表达和纯化带有标记的人蛋白，然后将这些蛋白固定在经微细加工的微阵列表面上实现高通量的结合筛选。然而这些微阵列技术的蛋白通常非哺乳动物细胞表达，缺少完整的哺乳动物细胞的糖基化模式，可能缺少天然构象。另外，虽然研究报道称可溶状态下的也具备一定生理活性，但只有成功整合在膜上，具有正确折叠构象的蛋白才能成为真正意义上的功能性膜蛋白，才能真正用于药物的靶向性评估。

近年来，计算机和AI技术在抗体脱靶分析中的应用也愈发受到关注，目前诸多科研团队正致力于开发各种AI模型用于预测分子的脱靶效应，但仍然面临一些挑战，例如抗体的三维结构对其脱靶效应有很大影响，但目前基于计算机的抗体结构预测尚不精确，此外，AI模型需要大量的已知数据才能进行有效的训练，而在抗体设计领域，此类数据集相对较少。

任何技术的开发与迭代永远来源于创新意识和市场的需求，人质膜蛋白阵列技术便是这种需求下的产物。它的开发背景是，人质膜蛋白（plasma membrane protein：包括单次跨膜、多次跨膜、GPI锚定蛋白以及离子道通和转运蛋白等）通常会折叠成构象复杂的结构锚定在质膜上，继而发挥离子运输、细胞间相互作用、受体介导的信号转导、酶促反应和免疫识别等重要生物学功能，是重要的药物研发靶点，抗体药或细胞治疗药物的脱靶分析都逃不开对膜蛋白的研究。因此，将所有的质膜蛋白分别表达在工具细胞系表面（通常为HEK-293T），让其保持结构完整性和天然的翻译后修饰，形成包含多种膜蛋白的不同细胞阵列，之后将待检分子与其孵育结合，通过一定的标记方法明确待检分子特异性，这便是人质膜蛋白阵列技术的基本原理。相较于其他脱靶分析方法，膜蛋白阵列具有更高的灵敏度与通量，因为其是在蛋白层面对候选分子（抗体、scFv）的脱靶可能性进行筛选，故能够直接找出与待检分子有结合的具体蛋白，为药物的研发策略提供更有效的指导支持。

在上一篇推文“神秘的人质膜蛋白阵列技术究竟是什么”中我们提到，由于庞大的人质膜蛋白数量以及技术壁垒，此前国际上只有美国公司的（Membrane Proteome Array，）平台以及英国Retrogenix（2021年被Charles River收购）的 (Cell Microarray Technology)平台是被全球广泛应用的两大膜蛋白阵列平台，披露的官方数据已证实这两个平台产生的大量IND（研究型新药）或BLA（生物制品许可申请）申报数据已获得美国FDA、EMA、PMDA和NMPA等机构的认可。

同时在国内，随着行业法规和指导原则的逐步完善，人质膜蛋白阵列技术的重要性逐渐从幕后走向台前。例如，CDE在《基因修饰细胞治疗产品非临床研究与评价技术指导原则》中明确指出，基因修饰的免疫细胞应尽可能采用多种方法评估靶点相关毒性和脱靶毒性，对于CAR修饰的免疫细胞，应采用体外方法（如人质膜蛋白阵列技术等）评估其胞外抗原识别区（一般为抗体的单链可变区片段）与人体膜蛋白的脱靶结合风险，事实上，目前由从业者了解到的信息已指明，CAR-T药物在IND申报时必须要提供人质膜蛋白阵列技术的检测数据；又如，在《抗肿瘤抗体偶联药物临床研发技术指导原则》中也强调了需要对靶抗原结合特异性进行研究,着重关注脱靶造成的相关毒性；《单克隆抗体药物风险因素分析及非临床研究与评价的一般考虑》中同样提出，建议采用灵敏度更高的人细胞质膜蛋白细胞阵列法预测脱靶风险等等，这些都已经说明人质膜蛋白阵列技术在行业内的重要地位，已然成为了新药脱靶评价的一把利器。

但对于国内研究者而言，使用人质膜蛋白阵列技术曾经并不友好，因为检测费用高昂、样本运输复杂以及反馈及时性等问题显得十分不便，这均是苦于没有一款国产化的技术平台。现如今，科技有限公司弥补了国内市场在新药脱靶评价领域的空白，打造了具有自主知识产权的人质膜蛋白阵列平台，6000+的蛋白库容除了包含各种类型的人质膜蛋白外还添加了广泛的高置信度分泌蛋白。在载体设计、构建及转染等环节均设置严格的质控环节，以确保构建cDNA的质粒准确无误，均能够在工具细胞中表达具有天然构象和翻译后膜蛋白，后通过高灵敏度高通量的化学发光检测技术与流式技术结合，鉴定与膜蛋白结合的抗体、药物或其他配体的靶向特异性。守衡生物提供的检测报告，可为IND申报提供有力支持。目前已有合作伙伴通过提交守衡生物的MPA数据报告，成功IND申报并获得了CDE默示许可。

除了新药脱靶评估之外，此平台还可以应用于新靶点的开发、病毒机制研究以及配受体脱孤领域。凭借丰富的平台搭建和案例检测经验，守衡生物有足够信心和国际平台竞争，如果您正在为样品送海外检测而烦恼，敬请关注守衡生物的人质膜蛋白阵列平台，相信会给带来满意的解决方案！

参考文献：

[1] Emma C.Scott,et.al.Nature. 21 June 2023.

[2] 余珊珊，王海学，胡晓敏，林志，邱云良，王庆利.组织交叉反应试验在非临床安全性评价中的应用及案例分析.2016年第6期634-638.

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